سنجش پروتئین ها (بخش دوم ، بیسین چونینیک ، برادفورد)

ویژگیهای تست بیسین چونینیک (BCA)
• حساسیت زیاد و سریع ، اگر در دماهای بالا مورد استفاده قرار گیرد .
• سازگار با بسیاری از دترجنت ها
• واکنشگر پایدار
• اختلاف بسیار کم در واکنش با پروتئین های متفاوت
• رنج کاری خطی عریض
• واکنشگر وقتی در دمای اتاق به کار برده می شود ، تمام نمی شود .

تست بیسین چونینیک (BCA)
1- مقدار لازم از واکنشگر تعیین پروتئین ، به وسیله اضافه کردن 1 حجم از سولفات مس به 50 حجم محلول بیسین چونینیک تهیه شود .
2- نمونه ها و استاندارد بووین سرم آلبومین (BSA) که در محدوده 0 تا 100 µg است ، در لوله ریخته شود . هر لوله باید حاوی 0.1ml حجم نمونه یا استاندارد باشد .
3- به هر لوله 2.0ml از واکنشگر تعیین پروتئین اضافه گردد و ورتکس شود .
4- لوله ها برای مدت 15min ، در 60oC نگهداری شود .
5- لوله ها را در دمای محیط سرد کرده و جذب آن ، در 562nm خوانده شود .

تست برادفورد (Bradford)

کمپلکس برادفورد

• CBBG اولیه با آرژنین باقی مانده واکنش می دهد . ( 8 مرتبه بیشتر از باقیمانده های لیست شده در تصویر )
• اگر پروتئین شما آرژنین زیادی دارد ، شما به استانداردی نیاز دارید که آرژنین زیادی داشته باشد .
• CBBG با این باقیمانده ها در فرم آنیونیک باند شده و جذب آن در 595nm خواهد بود . (آبی)
• رنگ تنها با فرم کاتیونی می باشد و جذب آن در 470nm می باشد .
کمپلکس برادفورد

• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram
quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976
• (Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990

ویژگیهای تست برادفورد (Bradford)
• ارزان و سریع
• بسیار ویژه برای پروتئین ها
• بسیار حساس [1-20 µg (micro assay) 20-200 µg (macro assay)]
• سازگار با طیف وسیعی از مواد
• واکنشگر کمپلکسی است که تقریبا یک ساعت پایدار می ماند .
• کرو استاندارد ، غیر خطی است .
• جوابگو برای پروتئین های گوناگون ، انتخاب استاندارد بسیار مهم است .

• طیف جذبی فرمهای آنیونی و کاتیونی بر روی هم می افتد .
• لذا کرو استاندارد خطی نیست ، اگر چه که تهیه کنندگان این کیت ها اصرار بر خطی بودن آن دارند .
• خطی بودن آن در پهنای غلظتی کوچکی است .
• اگر نمونه شما بیشتر از 20 µg باشد ، بهتر از یک منحنی درجه دوم به جای یک خط راست استفاده شود .

منحنی استاندارد لوری و برادفورد و بیسین چونینیک

تست برادفورد (Bradford)

1- قبل از استفاده از اسپکتوفوتومتر ، آن به مدت 15 دقیقه ، روشن شود .
2- نمونه ها توسط بافر رقیق شود . حدود µg/ml 1-20
3- استانداردها که حاوی 1-20 µg پروتئین می باشد ، تهیه شود . (آلبومین یا گاما گلبولین ترجیحا) .و به حجم 200µl رسانده شود . (اگر از سود 1M استفاده می شود ، به حجم 100µl رسانده شود) .
4- نمونه های مجهول را که مقدار حدودی µg 1-20 پروتئین دارند ، در لوله ریخته و به حجم 200µl رسانده شود . (اگر از سود 1M استفاده می شود ، به حجم 100µl رسانده شود).
5- به هر نمونه 100µl سود 1M اضافه شده و ورتکس شود .
6- به هر کدام از لوله ها 800µl واکنشگر اضافه کرده و 5 دقیقه در دمای اتاق بماند .
7- جذب در 595nm خوانده شود .

Xin Li

Scott Group

05/10/2005

نظرات شما عزیزان:

ساعت9:54---13 دی 1393

[وب سایت]

مژگان نور

ساعت9:31---8 تير 1393

[وب سایت] - [ایمیل]

با عرض سلام و تشکر از مطالب مفید. من کارشناس آزمایشگاه هستم متاسفانه نتوانستم جداول را ببینم لطفا در صورت امکان این فایل را برایم بفرستید

pari

ساعت9:54---20 شهريور 1392

[وب سایت]

عالی بود یه دنیاممنون

eli

ساعت9:55---2 آبان 1391

خیلی خوب بود استفاده کردم

e;i

ساعت22:57---1 آبان 1391

nasim

ساعت11:32---7 آذر 1390

man daneshjuye doctoraye zist shenasi hastam vaghean matatelb khub va karbbordi erae dadid, mamnunammmmm
پاسخ: موفق باشید

[+] نوشته شده توسط ابوذر عسکری در شنبه 21 اسفند 1389برچسب:بیسین چونینیک,برادفورد,اولترا ویولت,لوری,بیوره,سنجش پروتئین ها,کمپلکس لوري,کمپلکس بیوره,اندازه گیری غلظت پروتئین ها,تعیین پروتئین ها,

در ساعت 12:54 | |

درباره وبلاگ

پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)